Gydymas kartu su esculinu ir eritropoetinu apsaugo nuo inkstų išemijos – reperfuzijos pažeidimo dėl P2X7 receptorių slopinimo ir PI3K / Akt aktyvinimo

Augalinė medžiaga

Vachelia farnesiana gėlės buvo surinktos iš Al-Qaliobia gubernijos, Egipto 2020 m. kovo mėn. Surinkto augalo identifikavimą ir autentiškumą atliko dr. Terase Labib, Floros ir taksonomijos departamentas, El-Orman botanikos sodas, Giza, Egiptas. Kupono egzempliorius (Nr. Vf / fl / 2020) saugomas sodo herbariume. Eksperimentinius augalų tyrimus ir lauko tyrimus, įskaitant augalinės medžiagos rinkimą, patvirtino TBRI tyrimų etikos komitetas ir jie atitiko atitinkamas institucines, nacionalines ir tarptautines gaires bei teisės aktus.

Ekstrahavimas ir frakcionavimas

Šviežios gėlės V. farnesiana (1,350 kg) buvo mirkomi 3 dienas 85% metanolyje (5 × 2 l) kambario temperatūroje. Sujungti ekstraktai filtruojami ir išgarinami vakuume, naudojant rotacinį garintuvą, kad gautų 85% metanolio ekstraktą (132,85 g). Išdžiovintas vandeninis metanolio ekstraktas buvo nuriebalintas naudojant petrolio eterį (60–80 °C). Tada metanolio ekstraktas, iš kurio pašalinti riebalai, nuosekliai frakcionuojamas naudojant organinius tirpiklius (pvz., dichlormetaną, etilo acetatą ir n-butanolis), kad gautų 17,36, 15,85, 21,43, 43,74 ir 31,18 g petrolio eterio, dichlormetano, etilo acetato, n-butanolis ir atitinkamai vandens ekstraktai.

ESC junginio chromatografinis išskyrimas ir gryninimas

Tirto ekstrakto cheminės sudedamosios dalys buvo preliminariai identifikuotos naudojant „Thermo Finnigan“ („Thermo electronic Corporation“, OK, JAV), sujungtą su LCQ Duo jonų gaudyklės masės spektrometru su ESI šaltiniu neigiamos jonizacijos režimu („ThermoQuest Corporation“, Ostinas, Teksasas, JAV). )54. Po to etilo acetato ekstraktas (20,0 g) buvo frakcionuotas naudojant kolonėlės chromatografiją (5 × 60 cm), užpildytą poliamidu 6S kaip stacionarią fazę, ir eliuuojamas per gradiento mišinio eliuavimo sistemą (Vanduo: MeOH). Iš viso gautos penkios pagrindinės subfrakcijos (F1 – F5). Gautos subfrakcijos (F1 – F4) buvo atskirai papildomai išgrynintos naudojant kelias Sephadex LH-20 subkolonėles (2 × 30 cm), eliuuojamas (vanduo: MeOH su MeOH gradientu), kad gautų galo rūgštį, metilgalatą. , p– kumarino rūgštis, kvercetinas, taksifolinas, naringeninas ir kvercetinas 3-O– gliukozidas. Tuo tarpu F5 (5,2 g), išplautas 85% MeOH iš pagrindinės poliamido kolonėlės, papildomam gryninimui buvo paveiktas keliomis Sephadex LH-20 antrinėmis kolonėlėmis, eliuuojamas metanolio: vandens gradiento mišinio eliuavimo sistemoje, kad gautų ESC.

Gyvūnai

Keturiasdešimt Sprague – Dawley žiurkių patinų, sveriančių 280–300 g, buvo laikomos Theodoro Bilharzo tyrimų instituto (TBRI) gyvūnų namuose, Egipte. Žiurkės buvo laikomos atskiruose polipropileno narvuose 22–25 ° C temperatūroje, 12–12 valandų tamsos ir šviesos cikle ir laisva prieiga prie standartinės laboratorinės maisto dietos ir vandens. Visos procedūros buvo atliktos laikantis Nacionalinių sveikatos institutų laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovo (aštuntasis leidimas), buvo laikomasi ARRIVE gairių ir patvirtintas TBRI tyrimų etikos komiteto dėl eksperimentų su gyvūnais atlikimo. PT: 584; 2021-02-22).

Chirurginės procedūros

Kiekviena žiurkė buvo anestezuota 6% desflurano (Desflurane®, Baxter, UK) 100% tūrio deguonies įkvėpus. Žiurkės buvo paguldytos gulimoje padėtyje, po dezinfekcijos 70% alkoholiu nuskuta pilvo oda ir padarytas vidurinės linijos laparotominis pjūvis. Vėliau abu inkstai su jų žiedkočiais buvo švelniai atidengiami ir ant abiejų inksto arterijos ir venos buvo dvišaliai uždėti netrauminiai kraujagyslių spaustukai (buldogo spaustukai). Po 45 min. sėkminga reperfuzija buvo gauta nuėmus spaustukus, atkuriant kraujo tiekimą. Chirurginiai pjūviai buvo susiuvami ir uždengiami sterilia marle. Po anestezijos žiurkės buvo grąžintos į sterilius narvus 24 valandoms su laisva prieiga prie maisto ir vandens. Identiška operacija buvo atlikta netikrajai grupei, neužspaudus dvišalių inksto pedikėlių.

Eksperimentinis dizainas

Žiurkės buvo atsitiktinai suskirstytos į penkias grupes po aštuonias žiurkes kiekvienoje grupėje. Gyvūnų grupės buvo tokios; Apgaulė (gauta tik transporto priemonė), transporto priemonė + RI / R, ESC + RI / R, EPO + RI / R ir ESC + EPO + RI / R. Žiurkės buvo iš anksto apdorotos ESC (50 mg / kg11) arba nešiklį (0,5 % karboksimetilceliuliozės fosfatiniame buferiniame fiziologiniame tirpale (PBS), Sigma Aldrich, JAV) per burną zondą 7 dienas ir 30 minučių prieš RI/R. Tuo tarpu EPO (Eprex®, Janssen-Cialg, Šveicarija) buvo skiriama viena 1000 V/kg doze, IP, 30 min.20 prieš RI / R. Praėjus 24 valandoms po reperfuzijos, žiurkės buvo numarintos taikant lengvą anesteziją, įkvėpus izofluraną (Forane®, Baxter, JK), tada buvo paimtas kraujas ir inkstų audiniai ir apdoroti tolesniems biocheminiams, RT-PGR, histopatologiniams ir imunohistocheminiams (IHC) tyrimams. .

Biocheminės analizės

Paimti kraujo mėginiai buvo centrifuguojami 3000 ×g 10 min., po to serumai buvo atskirti ir laikomi -80 °C temperatūroje, kad būtų galima spektrofotometriškai įvertinti kreatinino ir karbamido kiekį (Biodiagnostics, Egiptas), o su neutrofilų želatinaze susieto lipokalino (NGAL) lygiai buvo nustatyti naudojant komercinį su fermentu susietą. imunosorbento tyrimo (ELISA) rinkinys (MyBiosource San Diego, JAV), pagal gamintojo instrukcijas.

Be to, dalis dešiniojo inksto buvo homogenizuota lediniame PBS, o supernatantai buvo naudojami malondialdehido (MDA), glutationo peroksidazės (GPx) ir superoksido dismutazės (SOD) lygiams matuoti naudojant specialius tyrimo rinkinius, kaip aprašyta gamintojo (Biodiagnostics). , Egiptas). Be to, naviko nekrozės faktoriaus (TNF) -α, interleukino (IL) -1β, NF-κB p65, endotelio azoto oksido sintazės (eNOS), p-PI3K, p-Akt, bax ir bcl2 lygiai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant specifinius komercinius. ELISA rinkiniai pagal gamintojo instrukcijas (MyBiosource San Diego, JAV).

Kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija (qRT – PGR).

Bendra RNR buvo išskirta iš homogenizuotų inkstų audinių naudojant Easy-spin RNR ekstrahavimo rinkinį (Intron biotechnology, Korėja). Tada RNR buvo paversta jos komplementaria DNR (cDNR) RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermoscientific, JAV). qRT-PGR buvo atlikta naudojant StepOne™ Real-Time PGR (Applied Biosystems, JAV), naudojant Maxima SYBR Green qPCR Master Mix, be ROX (2 ×) (Thermoscientific, JAV), pagal gamintojo instrukcijas. Atvirkštinės transkripcijos reakcijos sąlygos buvo apdorotos 42 ° C temperatūroje 15 minučių, po to 3 minutes 95 ° C temperatūroje. Šiluminio ciklo sąlygos buvo apdorotos 95 ° C išankstiniu denatūravimu, po to 40 ciklų (95 ° C 15 s; 60 ° C 30 s; 72 ° C 60 s). Buvo naudojami šie oligonukleotidiniai pradmenys: 5′-GTGGAGATCCTAGGTTTCTCTG-3 ′ (sense), 5′-CAGGATCTCATTCTCTTGGATC-3 ′ (antisense) NLRP3, 5′-TTCTTCCCCTACATCCTGCT-3) antisense (CCCTACATCCTGCT-3) 1, 5′-CTACTCTTCGGTGGGGGCTT-3 ′ (jutimas), 5′-CTCTGGATCCGGGTGACTTT-3 ′ (antisense), skirtas P2X7R, 5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3 GGGG (5′-ACACCACGGTTTGGACTATGG-3) 3 ′ (jutimas), 5′-AGCGAAGAAGGAGTTGGTGTC-3 ′ (antisensas) Akt ir 5′-TGATACAAAGACGGGGATATGGG-3 ′ (jutimas) ir 5′-CCT AT (CT) vidinei β-aktino kontrolei normalizuoti. tiksliniai genai pagal 2−ΔΔCt metodas55. Visi qRT-PCR ekspresijos eksperimentai buvo atlikti trimis egzemplioriais, siekiant užtikrinti gautų rezultatų atkuriamumą.

Histologinis tyrimas

Inkstai buvo nuodugniai ištirti dėl kortiko-meduliarinės demarkacijos, kraujavimo ir nekrozės. Tada mėginiai iš kairiojo inksto buvo suskirstyti į dvi dalis – viena skirta histopatologijai, o kita – elektroninės mikroskopijos tyrimams. Trumpai tariant, inkstų audiniai buvo nedelsiant fiksuoti 10% formalino tirpale, apdoroti ir įterpti į parafiną. Po to 4 mikronų storio pjūviai buvo nudažyti: (1) hematoksilino ir eozino (H&E) dažais, kad būtų galima histologiškai įvertinti parenchimos pažeidimą (vamzdelių pažeidimo nekrozė, intersticinis uždegiminis infiltratas ir glomerulų pokyčiai, 2) periodiniu rūgšties ir Šifo (PAS) reagentu. išryškinti kapiliarų ir kanalėlių bazines membranas ir (3) Massono trichromo (MTC) dažymą, kad būtų galima įvertinti fibrozę ir išryškinti fibrinoidinę nekrozę bei fibrino trombozę. Kiekvienoje sekcijoje buvo ištirta mažiausiai 10 kortikomeduliarinių laukų skirtingu padidinimu ir pusiau kiekybiniu tyrimu. atlikta tubulointersticinio pažeidimo analizė.Visas kanalėlių pažeidimas buvo įvertintas skalėje nuo 0 iki 4, remiantis normalių kanalėlių procentine dalimi ir pažeidimo mastu: 0, nėra; 1 (minimalus, 6–10%); 2 (židininis, 11–25 %); 3 (vidutinis, 26–50 %); 4 (išsklaidytas, > 50 %).

Perdavimo elektronų mikroskopas (TEM)

Inkstų mėginiai TEM buvo fiksuoti 2,5% glutaraldehido kakodilato buferyje 2 valandas 4 ° C temperatūroje. Tada audiniai du kartus plaunami po 1 valandą kakodilato-sacharozės buferyje ir 1 valandą fiksuojami 4 ° C temperatūroje 2% osmio tetroksido tirpale. Po dehidratacijos didėjančio laipsnio etanolyje mėginiai buvo impregnuoti Epon 812 pakaitalu (EMBed-812 rinkinys, Electron Microscopy Science, JAV) kambario temperatūroje ir polimerizuoti 60 ° C temperatūroje 48 valandas. Pusiau plonos pjūviai buvo supjaustyti, nudažyti metileno mėlyna-žydra II ir ištirti šviesos mikroskopu, kad būtų pasirinkta dominanti sritis itin plonam pjūviui. Tada itin plonos 70 A ° storio sekcijos buvo paruoštos naudojant Ultracut R ultramikrotomą (Leica, Viena, Austrija) ir dvigubai nudažytos uranilo acetatu ir švino citratu. Ultrastruktūriniai glomerulų kapiliarų kilpų, pamatinės membranos, podocitų ir kanalėlių pažeidimo požymių tyrimai buvo atlikti esant 80 kV, naudojant Philips EM 208 S elektroninį mikroskopą (Philips Optics, Eindhovenas, Nyderlandai), kurį pateikė TBRI Elektroninės mikroskopijos skyrius.

Imunohistocheminiai kaspazės-3 aktyvumo tyrimai

Formalinu fiksuotų ir parafinu įterptų audinių mėginių pjūviai (5 mikronų storio) buvo paruošti ant įkrautų stiklelių ir deparafinuoti, hidratuoti, tada apdoroti antigenui gauti esant aukštam pH (pH = 8), naudojant automatinį imuninį dažiklį (Sigma, Aldrich). , JAV). Triušio polikloniniai anti-kaspazės antikūnai (Sigma, Aldrich, JAV); apoptozei nustatyti buvo naudojamas praskiedimas 1:200. Ožkos anti-triušio biotinilinti imunoglobulinai / HRP (Sigma, Aldrich, JAV) buvo naudojami praskiedimu 1:300. Streptavidino – biotino – peroksidazės komplekso ir peroksidazės-DAB (3,3′-diaminobenzidinas) (Sigma, Aldrich, JAV) aptikimo metodas buvo atliktas pagal gamintojo nurodymus. Pjūviai buvo nudažyti Mayer hematoksilinu. Į kiekvieną bandymą buvo įtrauktos teigiamos ir neigiamos kontrolinės skaidrės. Kaip neigiama kontrolė, audinio pjūvis buvo apdorotas taip, kaip aprašyta, bet praleidžiant pirminį antikūną.

Statistinė analizė

Visi duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SD. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant vienpusę dispersijos analizę (ANOVA), po to Tukey – Kramer daugkartinio palyginimo post hoc testą parametrinei analizei, o Kruskal – Wallis testas ir Dunn post hoc buvo naudojamas neparametrinei analizei. Statistiniai skirtumai įvertinti naudojant GraphPad Prism programinę įrangą (JAV, 5.03 versija). Statistinis reikšmingumas buvo nustatytas ties p<0,05, p<0,01 ir p<0,001.

Parašykite komentarą

El. pašto adresas nebus skelbiamas.